إحداث ثورة في تعداد المستعمرات - عداد المستعمرات

إن عالم الحياة المجهري مليء بالأسرار والاستكشافات اللانهائية، ويعتبر علم الأحياء الدقيقة أحد تلك المجالات الرائعة. سواء في مجال سلامة الأغذية أو المراقبة البيئية أو البحث العلمي، نحتاج إلى أدوات دقيقة وفعالة للكشف عن وجود الكائنات الحية الدقيقة وعددها.

في مختبرات وأبحاث علم الأحياء الدقيقة الحديثة، يعد عداد المستعمرات قطعة لا غنى عنها من المعدات في مختبرات علم الأحياء الدقيقة. ويمكنه حساب المستعمرات الميكروبية وتحليلها بسرعة ودقة، مما يوفر دعمًا موثوقًا للبيانات للبحث العلمي. تعد عدادات المستعمرات الآلية بالكامل أداة فعالة ظهرت مؤخرًا.

في هذه المقالة، سوف نقدم العديد من المعرفة الشائعة حول عدادات المستعمرات ونحلل مؤشرات الأداء الرئيسية الخاصة بها بالتفصيل.

تطوير طرق عد المستعمرات

كجزء من علم الأحياء الدقيقة وتكنولوجيا المختبرات، مرت عدادات المستعمرات بعدة مراحل من التطوير والتغيير. من أول العد اليدوي إلى تطبيق التكنولوجيا الآلية الحديثة. فيما يلي التغييرات التاريخية الرئيسية في تطوير عدادات المستعمرة:

1. مرحلة العد اليدوي: كانت أول طريقة لحساب المستعمرات هي حساب المستعمرات الميكروبية يدويًا على ألواح الآجار عن طريق الملاحظة البصرية. هذه الطريقة بسيطة، ولكن عبء العمل كبير وعرضة للخطأ.

2. إدخال غرف العد: في نهاية القرن التاسع عشر، تم إدخال غرف خاصة (مسحة بيتري وحجيرات العد). ساعدت هذه الأجهزة الباحثين على حساب المستعمرات الميكروبية بشكل أكثر دقة. وفي الوقت نفسه، ساعدت الغرف الفنية في تقليل التأثير البيئي وتحسين دقة عمليات التعداد.

3. العدادات الإلكترونية: في بداية القرن العشرين، ومع تطور التكنولوجيا الإلكترونية، تم تطبيق العدادات الإلكترونية تدريجيًا على عد المستعمرات. تستخدم هذه الأجهزة التكنولوجيا الإلكترونية للعد وتحسين سرعة ودقة العد.

4. الأتمتة والرقمنة: مع تقدم تكنولوجيا الكمبيوتر، أصبحت عدادات المستعمرات تدريجيًا مؤتمتة ورقمية. أصبح العد ومعالجة البيانات أكثر كفاءة ودقة، في حين يمكن إنشاء تقارير تحليل أكثر تفصيلا.

5. تكنولوجيا تحليل الصور: في القرن الحادي والعشرين، تم تطبيق تكنولوجيا تحليل الصور في عد المستعمرات. يمكن للكاميرات الرقمية وبرامج معالجة الصور التقاط وتحليل صور المستعمرات على ألواح الأجار لأتمتة عملية العد والتحليل.

6. تكنولوجيا المراقبة في الوقت الحقيقي: تجمع المراقبة في الوقت الحقيقي لنمو الميكروبات وتكوين المستعمرة بين أجهزة الاستشعار والأنظمة الآلية ونقل البيانات في الوقت الحقيقي لمراقبة نمو الميكروبات بشكل أسرع.

7. تقنية الموائع الدقيقة: بدعم من تقنية الموائع الدقيقة، يصبح تعداد المستعمرات وتحليلها أكثر تصغيرًا ويتمتع بإنتاجية عالية. تسمح رقائق ميكروفلويديك بالعد والتحليل المتزامن لمستعمرات متعددة على نطاق صغير.

كيفية حساب المستعمرات البكتيرية

الملاحظة المباشرة

يتم حساب جميع المستعمرات المرئية عن طريق الملاحظة البصرية. على الرغم من أن معظم الاختبارات اليومية تتم عن طريق صب الأطباق، إلا أن طريقة المسحة تكون أكثر فائدة في الكشف عن الكائنات الحية الحساسة للحرارة. إنه يعطي نتائج عد أفضل وأكثر ملاءمة للبكتيريا الهوائية البحتة. مساوئ طريقة المسح هي عدم تجفيف سطح الآجار أثناء التلطيخ ونشر المستعمرات بعد فشل عملية الحضانة في العد.

عداد مستعمرة

يمكن حساب عدد المستعمرات الموجودة على اللوحة عن طريق الملاحظة البصرية المباشرة أو بمساعدة أداة. عداد المستعمرة عبارة عن أداة اختبار بكتيرية أوتوماتيكية من نوع العرض الرقمي. وهي تشتمل على عداد، ومسبار، وحوض العد، وأجزاء أخرى.

مبدأ عمل العداد الإلكتروني هو تحديد تغير مقاومة السائل في الثقب الصغير. لا يمكن للثقب الصغير أن يمر إلا عبر الخلية؛ وعندما تمر خلية من خلال هذا الثقب الصغير، تزداد المقاومة بشكل ملحوظ، لتشكل نبضة يتم تسجيلها تلقائيًا على جهاز التسجيل الإلكتروني. والطريقة أكثر دقة في قياساتها، لكنها تحدد حجم الجسيم فقط ولا تميز ما إذا كانت بكتيريا. لذلك، يجب ألا يحتوي المعلق البكتيري على أي حطام.

ينقسم عداد المستعمرة المعتاد إلى ثلاثة أنواع: يدوي، وشبه آلي، وآلي بالكامل، ويمكن اختيار عدادات مختلفة وفقًا لمتطلبات الدقة.

3. طريقة قياس العكر

تحدد طريقة قياس العكر بشكل غير مباشر عدد البكتيريا وفقًا لانتقال الضوء للمعلق البكتيري. يتناسب تركيز المعلق البكتيري في نطاق معين والنفاذية عكسيا مع الكثافة الضوئية. ولذلك، يمكن استخدام مقياس الألوان الكهروضوئي لتحديد التعليق البكتيري، وتشير الكثافة البصرية (قيمة OD) إلى تركيز التعليق البكتيري للعينة.

هذه الطريقة بسيطة وسريعة، لكنها لا تستطيع إلا اكتشاف المعلق الذي يحتوي على عدد كبير من البكتيريا؛ العدد النسبي للبكتيريا ولون العينة داكنان جدًا ولا يمكن تحديدهما بهذه الطريقة.

4. تحديد إجمالي النيتروجين الخلوي أو إجمالي الكربون

يعتبر النيتروجين والكربون المكونين الرئيسيين للخلية؛ المحتوى أكثر استقرارًا، ويمكن استخلاص تحديد محتوى النيتروجين والكربون من جودة الخلية. هذه الطريقة مناسبة لتركيزات أعلى للكشف عن الميكروبات.

5. طريقة عد الخلايا الحية

تعتمد طريقة حساب مستعمرات الصفائح شائعة الاستخدام على مبدأ أن كل بكتيريا حية يمكن أن تنمو في تصميم مستعمرة. خذ كمية معينة من التعليق البكتيري، وقم بإجراء سلسلة من التخفيفات، ثم التخفيف الكمي لثقافة اللوحة، وفقًا لعدد المستعمرات المستزرعة، يمكن حساب عدد البكتيريا الحية.

هذه الطريقة حساسة للغاية وتكتشف عدد البكتيريا الحية الملوثة، وكذلك طرق الكشف الميكروبيولوجية الدولية الحالية المستخدمة في العديد من البلدان. وتجدر الإشارة إلى استخدام هذه الطريقة:

1. حدد بشكل عام عدد المستعمرات بين اللوحة من 30 إلى 300. يعتبر العدد الزائد أو القليل جدًا غير دقيق؛

2. من أجل منع المستعمرات من الانتشار والتأثير على العد، يمكن إضافة 0.001% من كلوريد 2,3,5-ثلاثي فينيل تيترازوليوم (TTC) إلى وسط الاستزراع؛

3. تقتصر هذه الطريقة على الكائنات الحية الدقيقة المكونة للمستعمرة. يُستخدم الاختبار البكتيري على نطاق واسع في الماء والحليب والغذاء والأدوية وغيرها من المواد، وهو طريقة شائعة الاستخدام للكشف الميكروبيولوجي.

6. تحديد طريقة وزن الخلية

وتنقسم هذه الطريقة إلى طرق الوزن الرطب والجاف. طريقة الوزن الرطب هي وحدة حجم الاستزراع عن طريق الطرد المركزي بعد وزن الجسم البكتيري الرطب؛ طريقة الوزن الجاف هي وحدة حجم الاستزراع عن طريق الطرد المركزي، وغسلها بالماء ووضعها في مجفف التسخين والتجفيف، بحيث تفقد الرطوبة ثم وزنها. هذه الطريقة مناسبة للعينات التي تحتوي على تركيزات عالية من البكتيريا وهي طريقة شائعة للاختبارات الميكروبيولوجية.

كيفية حساب المستعمرات البكتيرية على طبق أجار

وفقًا لمبادئ عد المستعمرات ISO 7218: 2007 (E)، تم إجراء العد على النحو التالي:

إذا كان هناك تخفيفان متتاليان لرقم مستعمرة اللوحة (N) في حدود 100 ~ 300، وفقًا للصيغة أدناه.

N = ΣC/Vx1.1 xd : N رقم مستعمرة اللوحة؛ ΣC - اللوحة (بما في ذلك النطاق المناسب لعدد مستعمرة اللوحة) مجموع عدد المستعمرات؛ V - تلقيح حجم المحلول البكتيري. د - عامل التخفيف (التخفيف الأول).

يتم عرض النتائج بأعداد صحيحة مع رقمين معنويين، ويتم تقليصها إلى أقرب رقم صحيح وفقًا لمبدأ 'التقريب'. ويمكن التعبير عنها أيضًا على شكل أس 10 (التدوين العلمي)، مقسمًا إلى رقمين معنويين وفقًا لمبدأ 'التقريب'.

وعندما يكون الرقم الموجود على اللوحة أقل من 10 يتم العد في أربع حالات. 1:

1. عندما يكون عدد المستعمرات على اللوحة أقل من 10 وأكثر من 4، يتم حساب النتائج باستخدام الطرق الواردة في الجزء الأول ويتم الإبلاغ عنها كتقديرات.

2. عندما يكون عدد المستعمرات على اللوحة أقل من 3 وأكبر من 1، تكون الدقة منخفضة جدًا ويتم الإبلاغ عن النتائج ككائنات دقيقة تم اكتشافها وأقل من 4/d CFU/g(mL).

3. عندما لا يكون هناك أي مستعمرات على اللوحة، تكون النتيجة أقل من 1/d CFU/g (أو CFU/mL)، d هو عامل التخفيف، d=100=1 عندما لا يتم تخفيف العينة.

4. إذا كان عدد المستعمرات في التخفيف الأول d1 أكبر من 300 وجميعها مستعمرات نموذجية أو مؤكدة، فإن عدد المستعمرات في لوحات التخفيف d2 المتتالية أقل من 300 ولا توجد مستعمرات نموذجية أو مؤكدة مرئية. وكانت طريقة العد على النحو التالي:

5. يتم تسجيل النتائج على أنها أقل من 1/d1CFU/g (أو CFU/mL) وأكثر من 1/d2CFU/g (أو CFU/mlL).

6. إذا كان عدد المستعمرات الموجودة على اللوحة عند التخفيف الأول d1 أكبر من 300 ولا توجد مستعمرات نموذجية أو مؤكدة. طريقة العد هي كما يلي:

يتم تسجيل النتيجة على أنها أقل من 1/d2 CFU/g (أو CFU/mL).

عندما تحتوي لوحة التخفيف d1 الأولى على عدد مستعمرات أكبر من 300، فإن لوحة التخفيف d2 الثانية على التوالي تحتوي على عدد مستعمرات أقل من 10.

1. إذا كان عدد مستعمرة اللوحة للتخفيف الأول d1 يتراوح بين 300 و334، فاحسب كما كان من قبل.

2. إذا كان عدد مستعمرة اللوحة للتخفيف الأول d1 أكبر من 334 وكان عدد مستعمرة اللوحة للتخفيف الثاني على التوالي d2 أكبر من 8 وأقل من 10، يتم الإبلاغ عن العدد كتقدير وأقل من 1/d2 CFU/ ز (أو زيمبابوي/مل).

3. إذا كان عدد مستعمرة اللوحة للتخفيف الأول d1 أكبر من 334 وكان عدد مستعمرة اللوحة للتخفيف الثاني d2 أقل من 8، فإن النتيجة غير صالحة.

4. تعد مستعمرة اللوحة في تخفيفين متتاليين d1 وd2 أكبر من 300 ويتم الإبلاغ عن النتائج على النحو التالي: أكبر من 300/d2 أو أكبر من 300 xb/A x 1/d2. b هو عدد المستعمرات الإيجابية المؤكدة في المستعمرة المشبوهة A.

5. عندما يكون عدد المستعمرات (N') في اللوحة عند أعلى تخفيف بين 10 و300، يتم الحساب وفقًا للمعادلة التالية:
   N'=c/V×d حيث: عدد المستعمرات الموجودة على اللوحة؛ V عدد حجم البكتيريا الملقحة؛ د - عامل التخفيف.

عندما تكون هناك مستعمرة منتشرة، إذا كانت مستعمرة الانتشار أقل من ربع مساحة اللوحة، فيمكن حساب عدد المستعمرات في الجزء المتبقي، ومن ثم يمكن استنتاج عدد المستعمرات في اللوحة بأكملها؛ وإذا كان أكبر من الربع فلا يمكن إحصاؤه؛ مستعمرة متسلسلة، فقط كعد مستعمرة.

بعض المتطلبات في تحديد تعداد المستعمرات

لكي تعكس بشكل صحيح وجود مختلف البكتيريا الهوائية واللاهوائية جزئيا في الغذاء، يجب اتباع بعض المتطلبات واللوائح التالية في الاختبار:

الأدوات والمخففات المستخدمة:

1. يجب تعقيم الأواني الزجاجية المستخدمة في الاختبار، مثل أطباق بيتري والماصات وأنابيب الاختبار وما إلى ذلك، بالكامل وغسلها جيدًا قبل التعقيم، مع عدم وجود مواد مثبطة للجراثيم متبقية.

2. يجب أن يكون للسائل المستخدم كتخفيف العينة عنصر تحكم فارغ لكل دفعة. إذا ظهرت عدة مستعمرات على لوحة التحكم في الأجار، فيجب استخدام لوحة تحكم إضافية. من أجل تحديد التخفيف الفارغ، المستخدم لصب وسط طبق بتري، أو ماصة طبق بتري أو قد يكون هناك تلوث للهواء.

3. التحقق من تخفيف العينة. إذا كان ذلك مناسبًا، يمكن تعقيمه أو الماء المقطر، ولكن استخدم محلول ملحي بالفوسفات، وخاصة ماء الببتون 0.1%. لأن ماء الببتون الموجود على الخلايا البكتيرية يتمتع بحماية أفضل، وليس لأن عملية التخفيف وعينات الطعام قد تعرضت للتلف في الخلايا البكتيرية الأصلية مما أدى إلى الوفاة.

تخفيف عينات الاختبار:

1. تأكد من أن الحاوية معقمة عند تخفيف عينة الاختبار.

2. عند إزالة الماصة المعقمة من الأنبوب، لا تلمس طرف الماصة بالجزء المكشوف من الماصات الأخرى التي لا تزال في الحاوية، ولا تلمس الجزء الخارجي من فم الزجاجة وفم أنبوب الاختبار عندما إدخال أو الخروج من الزجاجات وأنابيب الاختبار التي تحتوي على سوائل مخففة؛

3. عند استنشاق السائل، يجب أولاً أن يكون أعلى من مقياس الماصة. ثم ارفع طرف الماصة بعيدًا عن سطح السائل ثم ضع الطرف على الجدار الداخلي للزجاجة أو أنبوب الاختبار لإجراء الشفط.

لوحة التلقيح والثقافة:

1. عند إضافة محلول التخفيف إلى طبق بيتري المعقم، حدد 2 إلى 3 تخفيفات مناسبة، على التوالي؛ للتخفيف المتزايد بمقدار 10 أضعاف، يجب أن يتكون كل تخفيف من طبقين بتري.

2. يجب تسخين الأجار المغذي المستخدم في صب أطباق بيتري مسبقًا حتى يذوب ويُحفظ دافئًا عند درجة حرارة 45 ± 1 درجة مئوية في حمام مائي بدرجة حرارة ثابتة ليتم استخدامه. عند صب أطباق بيتري، قم بملء كل طبق بحوالي 15 مل، وأخيرًا، الجزء السفلي من الأجار مع جزء الترسيب من المرتجع.

3. لمنع تكاثر البكتيريا وإنتاج مستعمرات قشرية، يجب إضافة محلول الاختبار إلى الطبق في غضون 20 دقيقة بعد إضافة الأجار إلى الطبق، وخلطه على الفور مع الأجار بالتساوي.

4. عند خلط عينة الاختبار مع الأجار، يمكن تدوير الجزء السفلي من الطبق على سطح مستو في اتجاه واحد أولاً ثم في الاتجاه المعاكس من أجل إجراء الخلط الكامل. يمكن أيضًا تحديد الخلاط التلقائي.

5. لا تترك الأجار في الطبق لفترة طويلة بعد أن يصلب. يجب قلب الآجار واحتضانه خلال دقائق قليلة بعد التصلب لتجنب انتشار المستعمرات. إذا لزم الأمر، يمكن فتح الطبق وقلبه (أسفل الطبق إلى أعلى) في الحاضنة بعد 15-60 دقيقة حتى يجف سطح الأجار، ثم ينقل الجزء السفلي من الطبق إلى الغطاء ويقلبه في الوعاء. حاضنة للزراعة.

اختبارات التحكم:

1. لتجنب الخلط مع المستعمرات البكتيرية، يمكن ترك طبق بتري من اختبار التخفيف الممزوج بالأجار عند درجة حرارة 4 درجات مئوية دون حضانة لاستخدامه كعنصر تحكم عند حساب مستعمرات الالتقاط.

2. يجب حفظ محلول TTC ​​في مكان بارد ومظلم لمنع التحلل بالحرارة والضوء.

عد مستعمرة:

1. عند إزالة أطباق بيتري من الحاضنة لعد المستعمرات، يجب أولاً ملاحظة نمو المستعمرات على الأطباق على طبقين بتري من نفس التخفيف وعدة حاويات من التخفيفات المختلفة، على التوالي. يجب أن يكون عدد التسويات مقارباً لعدد اللوحتين في اختبار التوازي. يجب أن يكون عدد المستعمرات الموجودة على عدة أطباق بتخفيفات مختلفة متناسبًا عكسيًا مع تخفيف عينة الاختبار، أي أنه كلما زاد تخفيف عينة الاختبار، انخفض عدد المستعمرات. كلما كان التخفيف أصغر، كلما زاد عدد المستعمرات.

2. ينبغي تحديد عدد المستعمرات بين 30 إلى 300 لوحة كمعيار لعد المستعمرات. 1 التخفيف باستخدام لوحين، وينبغي استخدام متوسط ​​اللوحتين؛ مثل أن تحتوي إحدى اللوحات على قطعة أكبر من نمو المستعمرة، فإنه ليس من المناسب استخدامها

احتياطات

1. إذا كان عدد المستعمرات الموجودة على اللوحة ذات التخفيف الكبير أعلى من تلك التي تحتوي على تخفيف صغير، فهذا خطأ في عمل الاختبار، أو حادث مختبري. بالإضافة إلى ذلك، قد يكون هذا أيضًا بسبب العوامل المثبطة للجراثيم الممزوجة في العينة، والتي لا يمكن استخدامها كأساس لتقرير عدد العينات.

2. إذا بدا أن اللوحة تحتوي على مستعمرات على شكل سلسلة، فلا توجد حدود واضحة بين المستعمرات. يحدث هذا بسبب تشتت الكتلة البكتيرية عند خلط الأجار مع عينة الاختبار.

جهاز استشعار سي سي دي

يعد مستشعر CCD أحد المكونات الأكثر أهمية في عداد المستعمرة. يمكن أن تؤثر درجتها بشكل خطير على استقرار نتائج العد والتحليل. تشتمل أجهزة التصوير اليوم على التصوير الفوتوغرافي والتصوير بالمسح الضوئي.

1. تصوير الصور: يمكن أن تضمن سرعة التصوير السريعة أن تكون صورة المستعمرة في 0.5 ثانية، ولكن يمكن أيضًا أن يكون التركيز التلقائي متعدد النقاط أو نقطة واحدة، وتكون دقة البكسل أعلى بشكل عام. ومع ذلك، فإن العيب هو أنه لا يمكن تحديد شدة الضوء في بيئة التصوير بدقة إلى مركز الصورة وحافة الصورة للحفاظ على الاتساق الكامل؛ إلى حد ما، فإنه يتداخل مع التحديد التلقائي لهدف المستعمرة.

2. مسح التصوير: لحل مشكلة السطوع غير المتساوي لهدف المستعمرة، والعد والتحليل لعملية مستقرة وبسيطة وسرعة تصوير سريعة، ودقة تصوير قابلة للتعديل. العيب باهظ الثمن.

قناة الحصول على الصور

تعد قناة الحصول على الصور جزءًا مهمًا آخر من عداد المستعمرة. فهو يحدد سرعة الحصول على واستقرار صورة المستعمرة. يمكن أن يؤدي اختيار عداد ذو سرعة عالية وثبات والعديد من مؤشرات قنوات الاستحواذ إلى تحسين الكفاءة والدقة التجريبية.

قرار مستعمرة

يشير تحليل المستعمرة إلى أصغر حجم للمستعمرة يمكن للعداد تمييزه وحسابه. دقة المستعمرة الأعلى تعني أن العداد يمكنه التعرف على المستعمرات الأصغر حجمًا، وبالتالي توفير نتائج عد أكثر دقة.

تتميز عدادات المستعمرات النموذجية للمبتدئين بحد أدنى من الدقة يبلغ حوالي 0.1 مم.

سهولة الاستخدام ووظائف الجهاز

يمكن أن يؤدي اختيار عداد مستعمرة سهل التشغيل ولديه الوظائف الضرورية إلى تحسين كفاءة التجربة. على سبيل المثال، يمكن لشاشات اللمس والعد التلقائي وتخزين البيانات وتصديرها وتحليل البيانات وإنشاء التقارير وإدارة المكتبة وغيرها من الوظائف تبسيط عملية التشغيل وتحسين كفاءة إدارة البيانات.

برامج التحليل

في التحليل، ينبغي النظر في اختيار البرامج لجميع أنواع تداخل التصوير مع قدرة التفريغ التلقائي. من الأفضل اختيار برنامج تحليل مزود بوظيفة التصحيح التلقائي لتحسين تأثير التصوير تلقائيًا.

راحة

تعد الراحة أيضًا أحد العوامل التي يجب مراعاتها عند اختيار عداد المستعمرة.

السعر وخدمة ما بعد البيع

أخيرًا، يجب عليك أيضًا أن تفكر في السعر وخدمة ما بعد البيع لعداد المستعمرة. قد يختلف السعر حسب العلامة التجارية والطراز والميزات، لذا اختر وفقًا لميزانية مختبرك. من المهم معرفة خدمة ما بعد البيع والدعم الفني للمورد للحصول على المساعدة والدعم في الوقت المناسب عند الحاجة.