كيف يكتشف التحليل اللوني السائل السكريات في الطعام

تعتبر الكربوهيدرات من أهم مصادر الطاقة في الجسم وتوجد على نطاق واسع في الأطعمة المختلفة. تشترك الكربوهيدرات في تركيبات كيميائية متشابهة، وغالبًا ما تكون طرق الكشف التقليدية غير قادرة على قياس محتوى السكر بدقة. التحليل اللوني السائل عالي الأداء (HPLC) هو الطريقة المفضلة للكشف عن خمسة كربوهيدرات شائعة في الطعام: الفركتوز والجلوكوز والسكروز والمالتوز واللاكتوز. تشرح هذه المقالة كيفية اكتشاف HPLC للكربوهيدرات في الطعام، وتصف الطرق التحليلية الرئيسية، وتشرح سبب بقائها الأداة التحليلية القياسية في مختبرات الأغذية الحديثة حتى يومنا هذا.

ما هي التحديات في تحليل الكربوهيدرات؟

يمثل تحليل مركبات الكربوهيدرات والكشف عنها تحديات تقنية متعددة، ولهذا السبب غالبًا ما تكون الطرق الكيميائية التقليدية غير كافية.

1. التشابه الهيكلي العالي يجعل الانفصال صعبا

الفركتوز والجلوكوز والسكروز والمالتوز واللاكتوز - الموجودة عادة في الغذاء - كلها كربوهيدرات ذات بنية جزيئية متشابهة إلى حد كبير. الفركتوز والجلوكوز كلاهما سكريات أحادية لها وزن جزيئي متطابق تقريبًا. السكروز والمالتوز واللاكتوز كلها سكريات ثنائية، ولكنها تتكون من وحدات سكريات أحادية مختلفة مرتبطة بروابط جليكوسيدية مختلفة. يؤدي هذا التشابه الهيكلي العالي إلى سلوك استبقاء مشابه جدًا عند تحليله في نفس النظام الكروماتوغرافي. إن تحقيق الفصل الأساسي المتزامن لهذه السكريات الخمسة يضع متطلبات عالية على الانتقائية ودقة العمود الكروماتوغرافي.

2. نقص الامتصاص المميز للأشعة فوق البنفسجية

لا تحتوي التركيبات الجزيئية للغالبية العظمى من السكريات على كروموفورات، مما يؤدي إلى استجابة ضعيفة للغاية أو حتى عدم الاستجابة في أجهزة الكشف التقليدية للأشعة فوق البنفسجية المرئية. وهذا يعني أنه، على عكس التحليل الكمي المباشر للمكونات الغذائية مثل الفيتامينات والمواد الحافظة باستخدام أجهزة الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية، يجب استخدام أجهزة الكشف الخاصة أو طرق الاشتقاق.

3. تكوين المصفوفة المعقدة

غالبًا ما تحتوي عينات الطعام الفعلية على مواد متداخلة متعددة، مثل البروتينات والدهون والأحماض العضوية والأصباغ. إذا كان إعداد العينة غير سليم، فإن هذه المكونات الموجودة قد تلوث العمود الكروماتوغرافي أو تحذف في وقت واحد مع السكريات المستهدفة، مما يؤثر بشدة على دقة التحليل النوعي والكمي.

مميزات التحليل الكروماتوغرافي السائل لتحليل السكريات

استجابة للتحديات المذكورة أعلاه، يقدم التحليل اللوني السائل عالي الأداء (HPLC) حلاً منهجيًا، مما يجعله الأسلوب المفضل لتحليل السكر.

1. قدرة فصل قوية

يستخدم HPLC الضغط العالي لدفع الطور المتحرك عبر عمود عالي الدقة، مما يتيح الفصل الفردي للسكريات ذات الهياكل المتشابهة للغاية. ويمكنه تحقيق الفصل الأساسي المتزامن لخمسة سكريات - الفركتوز والجلوكوز والسكروز والمالتوز واللاكتوز - في غضون اثنتي عشرة دقيقة أو نحو ذلك.

2. تكوين كاشف مرن

بالنسبة للمركبات مثل السكريات التي لا تمتص الأشعة فوق البنفسجية، يمكن تكوين أنظمة HPLC باستخدام كاشف معامل الانكسار (RID) أو كاشف تشتت الضوء التبخيري (ELSD). يستجيب كاشف معامل الانكسار عن طريق قياس الفرق في معامل الانكسار بين الطور المتحرك ومحلول العينة، مما يوفر إشارة استجابة مستقرة لجميع السكريات ويوفر عملية بسيطة. يوفر كاشف تشتت الضوء التبخيري (ELSD)، الذي يعمل من خلال الانحلال والتبخر واكتشاف تشتت الضوء، حساسية أعلى ومتوافق مع الشطف المتدرج. يتمتع كلا الكاشفين بمزاياهما الخاصة ويمكن اختيارهما بمرونة بناءً على متطلبات محددة.

3. نتائج موثوقة

لا يتيح التحليل اللوني السائل التحديد النوعي لمكونات السكر الفردية بناءً على وقت الاحتفاظ به فحسب، بل يسمح أيضًا بالتقدير الكمي الدقيق باستخدام الطرق القياسية الخارجية أو الداخلية. يصل معامل الارتباط الخطي للمنحنى القياسي عادة إلى 0.999 أو أعلى، مما يضمن موثوقية النتائج الكمية.

4. مجموعة واسعة من العينات القابلة للتطبيق

من المشروبات الصافية وعصائر الفاكهة إلى العسل اللزج والشراب، وكذلك منتجات الحبوب ومنتجات الألبان، يمكن للفصل اللوني السائل، عند دمجه مع خطوات المعالجة المسبقة المناسبة (التخفيف، الاستخلاص، الترشيح، وما إلى ذلك)، أن يغطي جميع مصفوفات الأغذية الشائعة تقريبًا.

كيفية اكتشاف الفركتوز والجلوكوز والسكروز والمالتوز واللاكتوز في الغذاء

تقدير الفركتوز والجلوكوز والسكروز والمالتوز واللاكتوز في الغذاء بواسطة تحليل كروماتوجرافي سائل LC-QGH3200Z لـ Scitek. في هذه الدراسة، تم استخدام نظام HPLC Scitek LC-QGH3200Z HPLC مع كاشف معامل الانكسار لإنشاء طريقة لتقدير السكريات الخمسة في الطعام وفقًا للمعيار الدولي ISO 11292 وAOAC 982.14. تم التحقق من صحة الطريقة من حيث ملاءمة النظام والخطية والتكرار وتم تطبيقها على الكشف الفعلي عن العينات، مما يوفر حلاً تحليليًا عمليًا وفعالًا لمختبرات اختبار الأغذية ومصنعي الأغذية والسلطات التنظيمية. فيما يلي الإجراء الكامل لتحديد هذه السكريات الخمسة باستخدام الفصل اللوني السائل مع كاشف معامل الانكسار (RID).

1. تكوين الصك

كروماتوجرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC) مجهزة بمضخة متدرجة ثنائية عالية الضغط أو مضخة إسقراطية

كاشف معامل الانكسار (RID)

Autosampler

فرن العمود

محطة عمل اللوني

2. الظروف الكروماتوغرافية

في ظل هذه الظروف، يتم تصفية السكريات الخمسة بالترتيب التالي: الفركتوز ← الجلوكوز ← السكروز ← المالتوز ← اللاكتوز، مع التخلص من جميع القمم خلال 16 دقيقة.

3. الأدوات والكواشف والمواد الاستهلاكية

الكواشف:

الماء عالى النقاء

الأسيتونيتريل (الصف الكروماتوغرافي)

المعايير المرجعية: الفركتوز (ماكلين)، الجلوكوز (داماس بيتا)، السكروز (الكاشف العام)، المالتوز (ماكلين)، اللاكتوز (علاء الدين)

المعدات الداعمة:

التوازن التحليلي

جهاز ترشيح المذيبات

نظافة بالموجات فوق الصوتية

مستلزمات المختبر:

أغشية المرشح: أغشية مرشح الطور المائي، 0.45 ميكرومتر

4. إعداد المحاليل القياسية

إعداد محلول مخزون قياسي مختلط (20.0 ملغ/مل): تزن حوالي 1 غرام لكل من الفركتوز المجفف (المجفف عند 90 درجة مئوية لمدة 2 ساعة)، والجلوكوز والسكروز والمالتوز واللاكتوز (جميعها مجففة عند 96 درجة مئوية لمدة 2 ساعة)، دقيقة إلى 0.001 جم. يذوب في الماء وينقل إلى دورق حجمي سعة 50 مل. أضف 2.5 مل من الأسيتونتريل وخففه إلى العلامة بالماء. يحفظ في درجة حرارة 0-4 درجة مئوية؛ صالحة لمدة 3 أشهر.

سلسلة من حلول العمل القياسية: ماصة 0.100، 1.00، 2.00، 3.00، و5.00 مل من محلول المخزون في قوارير حجمية منفصلة سعة 10 مل. تمييع بالماء حتى العلامة للحصول على سلسلة من المحاليل القياسية بتركيزات 0.200، 2.00، 4.00، 6.00، و10.0 ملغم/مل.

5. تحضير العينات

تختلف طرق تحضير العينة قليلاً حسب نوع الطعام:

العسل والشراب: تزن 1-2 جرام من العينة وتذوب في الماء ويصل الحجم إلى 100 مل. مزيج دقيق، واسمحوا الوقوف، ثم جمع المادة طافية. تصفية من خلال غشاء مرشح microporous 0.45 ميكرومتر قبل الحقن.

المشروبات: خذ العينة مباشرة، وقم بتفريغها باستخدام جهاز الموجات فوق الصوتية، ثم قم بتصفيتها من خلال غشاء مرشح صغير المسام بقطر 0.45 ميكرومتر، ثم قم بحقنها. إذا كان التركيز مرتفعًا جدًا، قم بتخفيفه بشكل مناسب.

منتجات الألبان ومنتجات الحبوب: تتطلب خطوات مثل ترسيب البروتين وإزالة الدهون واستخلاصها.

6. النتائج والمناقشة

ملاءمة النظام

تم حقن محلول العمل القياسي المختلط وفقًا للطريقة المتبعة، وتم الحصول على الرسم اللوني للسكريات الخمسة (الشكل 1). أظهرت خمسة سكريات قمم كروماتوغرافية حادة ومتناظرة مع عدم وجود قمم متداخلة. كان القرار بين القمم المجاورة أكبر من 1.5.

الشكل 1. اللوني للفركتوز والجلوكوز والسكروز والمالتوز واللاكتوز

الجدول 4. المعلمات الكروماتوغرافية للفركتوز والجلوكوز والسكروز والمالتوز واللاكتوز

الخطي

تم إنشاء المنحنيات القياسية مع التركيز (مجم/مل) باعتباره الإحداثي (x) ومنطقة الذروة كالإحداثي (y)، كما هو موضح في الشكل 2. وكانت معاملات الارتباط (R) لجميع السكريات الخمسة أكبر من 0.999، مما يشير إلى وجود علاقة خطية ممتازة بين التركيز ومنطقة الذروة في نطاق 0.200 مجم/مل إلى 10.0 مجم/مل.

الشكل 2. معادلات المنحنى ومعاملات الارتباط للفركتوز والجلوكوز والسكروز والمالتوز واللاكتوز

التكرار

تم حقن محلول العمل القياسي المختلط 7 مرات تحت نفس الظروف الكروماتوغرافية، وتم تسجيل وقت الاستبقاء ومنطقة الذروة لحساب الانحراف المعياري النسبي (RSD). وتظهر النتائج في الشكل 3. والجدول 5.

الشكل 3. التكرار اللوني للفركتوز والجلوكوز والسكروز والمالتوز واللاكتوز (ن = 7)

كان RSD لوقت الاحتفاظ لجميع السكريات الخمسة أقل من 0.3٪، وكان RSD لمنطقة الذروة أقل من 1.4٪. تظهر النتائج أن نظام SCITEK LC-QGH3200Z HPLC يتمتع بدقة وتكرار ممتازين، مع الاحتفاظ المستقر واستجابة الذروة المتسقة، والتي يمكن أن تلبي متطلبات الكشف الروتيني المتكرر للعينات.

الجدول 5. معلمات التكرار الكروماتوغرافي للفركتوز والجلوكوز والسكروز والمالتوز واللاكتوز

تحليل العينة الفعلية

تم تطبيق الطريقة المتبعة لتحديد محتوى السكر في عينة تجارية من شراب البشملة والكمثرى الخريفي. يظهر الرسم اللوني للعينة في الشكل 4، وتظهر نتائج الكشف في الجدول 6.

الشكل 4. اللوني من إسكدنيا التجارية وعينة شراب الكمثرى الخريف

بناءً على النتائج، يحتوي شراب الإسكدنيا والكمثرى الخريفي على الفركتوز والجلوكوز والسكروز والمالتوز بتركيزات 5.719728 ملجم/مل، 6.583038 ملجم/مل، 0.120169 ملجم/مل، و0.743335 ملجم/مل، على التوالي.

الجدول 6. المعلمات الكروماتوغرافية لإسكدنيا وشراب الكمثرى الخريف

الاحتياطات اللازمة لاستخدام العمود اللوني

الأعمدة ذات الروابط الأمينية هي النوع الأكثر استخدامًا من الأعمدة الكروماتوغرافية في تحليل الكربوهيدرات، ولكن يجب مراعاة الاحتياطات التالية أثناء الاستخدام:

يجب أن يكون محتوى الأسيتونتريل في الطور المتحرك عمومًا 60% على الأقل؛ بخلاف ذلك، تكون مرحلة الروابط الأمينية عرضة للتحلل المائي والترشيح، مما يقصر من عمر العمود؛

عندما لا يكون العمود قيد الاستخدام لفترة طويلة، يجب تخزينه بشكل صحيح وفقًا لنظام المذيبات الموصى به من قبل الشركة المصنعة؛

تأكد من تصفية العينات من خلال غشاء مرشح 0.45 ميكرومتر قبل الحقن لمنع الجسيمات من انسداد العمود.

المشكلات الشائعة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها

ذروة المخلفات أو الانقسام: قد يكون سبب ذلك تلوث العمود أو انخفاض كفاءة العمود. يمكن تجديد العمود عن طريق الغسل بمذيب مناسب، أو يمكن استبدال عمود الحماية.

انخفاض الدقة: تحقق مما إذا كانت نسب الطور المتحرك صحيحة، أو ما إذا كان العمود قد وصل إلى نهاية مدة خدمته.

الانجراف الأساسي: كاشف معامل الانكسار حساس لدرجة الحرارة. تأكد من أن درجات حرارة فرن العمود والكاشف مستقرة، وأن الطور المتحرك يتم تفريغه تمامًا.

خاتمة

أصبح التحليل اللوني السائل عالي الأداء (HPLC)، بقدراته الاستثنائية على الفصل، وتكوينات الكشف المرنة، والأنظمة الكمية الراسخة، هو التقنية السائدة للكشف عن السكريات في الطعام. سواء من حيث النضج المنهجي أو شمولية المعايير واللوائح، فإن أسلوب HPLC-RID/ELSD يصمد أمام التدقيق الدقيق. بالنسبة لمصنعي المواد الغذائية، يساعد إتقان هذه الطريقة على ضمان التحكم الدقيق في تركيبات المنتج وجودته؛ وبالنسبة لمؤسسات الاختبار، فهو بمثابة أساس تقني حيوي لضمان سلامة الأغذية وحماية صحة المستهلك. ومع التقدم المستمر في تكنولوجيا التحليل الكروماتوغرافي، من المتوقع أن تتحسن الحساسية والسرعة ومستوى الأتمتة في تحليل الكربوهيدرات بشكل أكبر.