اختبر الاختلاف في طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وعزز إنتاجية مختبرك

يسمح تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بالتضخيم السريع لشظايا الحمض النووي في ظل الظروف المناسبة، مما يؤدي إلى العديد من تسلسلات الحمض النووي المستهدفة، وهو أمر ضروري للبحوث البيولوجية والجوانب العلاجية السريرية.

يؤثر كل مكون من مكونات تفاعل PCR على النتائج، ويعد التلدين أمرًا بالغ الأهمية للخصوصية العالية لـ PCR. للتأكد من أنه يمكنك إنتاج منتجات تضخيم قابلة للتكرار بنجاح دون تضخيم أو تلوث غير محدد، تحتاج إلى تحسين فرص تجارب PCR الناجحة من خلال التصميم التمهيدي المناسب وظروف التفاعل وبيئة معقمة.

أنواع PCR

التقليدية / نقطة النهاية PCR

هذا هو النوع الأكثر اقتصادا من تفاعل PCR ويمكن إجراؤه مباشرة باستخدام جهاز التدوير الحراري متبوعًا بالكشف عن التسلسل باستخدام الفصل الكهربائي للهلام. عند الاختبار فقط لوجود تسلسل الحمض النووي في العينة، يمكن أن يعطي تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي/نقطة النهاية إجابة سريعة في بضع دقائق.

متعدد PCR

يتميز Multiplex PCR باستخدام بادئات متعددة، مما يمكّن الباحثين من الحصول على أهداف متعددة في وقت واحد في نفس تفاعل PCR. يتطلب Multiplex PCR في كثير من الأحيان تحسينًا شاملاً لظروف التلدين لتحقيق أقصى قدر من كفاءة التضخيم باستخدام أنظمة قالب تمهيدي مختلفة. إنها طريقة فعالة من حيث التكلفة لتقليل العينة المطلوبة، وبالتالي زيادة الإنتاجية وتوفير الوقت مقارنة بتجارب PCR الفردية.

تعد إجراءات البدء السريع الصارمة وأنظمة المخزن المؤقت المُحسّنة خصيصًا ضرورية لنجاح تعدد إرسال PCR. ولذلك، لإجراء تجارب PCR متعددة ناجحة، يحتاج المجرب إلى التخطيط لتصميم التمهيدي وظروف التفاعل قبل التجربة لتقليل التفاعل المتبادل التمهيدي والربط غير المحدد. بالإضافة إلى ذلك، تحتاج إلى تنسيق درجات حرارة التفكيك للبادئات المختلفة للتأكد من قدرتها على تضخيم التسلسل المستهدف في وقت واحد.

PCR طويل المدى

يمكن لتفاعل البوليميراز المتسلسل طويل المدى تضخيم تسلسلات الحمض النووي الأطول من تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي، عادةً من 4 كيلو بايت إلى عشرات الكيلوبايز. مطلوب التحسين المتكرر أثناء التضخيم، وخاصة بالنسبة لمنتجات PCR أطول من 4 كيلو بايت. يجب أن تكون الاشعال محددة بما فيه الكفاية، ويجب أن تكون قيم الطول وTm عالية بما فيه الكفاية. من المرغوب أيضًا أن تكون الاشعال ذات خصوصية وطول وقيمة Tm كافية لضمان الارتباط المستقر بالتسلسل المستهدف.

خلية واحدة PCR

يتضمن PCR أحادي الخلية تضخيم الخلايا الفردية على PCR للحصول على معلومات حول أنواع الخلايا والتغيرات الديناميكية أثناء التطور. يمكن لقياس التدفق الخلوي أو التلاعب المجهري عزل الخلايا الفردية ذات الأهمية بناءً على علامات سطح الخلية أو المظهر الجسدي.

PCR سريع التدوير

وكما يوحي الاسم، فإن تفاعل PCR سريع التدوير يسمح بإكمال تفاعلات PCR في فترة أقصر، مما يؤدي إلى تقصير وقت الإعداد التجريبي وإتاحة المزيد من الوقت للباحثين للتحليل النهائي. يتطلب PCR سريع التدوير ظروف تفاعل محسنة وكواشف محسنة للغاية لضمان خصوصية التضخيم وحساسيته. وهو عرضة لتلوث الحمض النووي الخارجي، لذلك فإن التفاعل في بيئة معقمة أمر ضروري.

PCR الخاص بالميثيل (MSP)

يمكن لـ MSP تحديد حالة مثيلة الحمض النووي المستهدف بعد علاج ثنائي الكبريتيت. تتطلب الطريقة تصميم مجموعتين من البادئات: مجموعة واحدة للتصليب إلى السيتوزين غير المتغير (أي الميثلة في الحمض النووي الجينومي) ومجموعة أخرى للتصليب إلى اليوراسيل الناتج نتيجة معالجة ثنائي كبريتيت السيتوزين غير الميثيل في الحمض النووي الجينومي.

يجب عليك استخدام شروط PCR صارمة ومحددة للغاية لتجنب ربط التمهيدي غير المحدد وتضخيم مصنوعات PCR. وهذا مهم بشكل خاص. لأن تحويل السيتوزين غير الميثيلي إلى اليوراسيل يقلل من تعقيد الحمض النووي ويزيد من احتمالية الارتباط غير المحدد بالقالب التمهيدي.

بداية ساخنة PCR

يجب أن يمنع تطبيق PCR البدء الساخن نشاط البلمرة قبل البدء، مما يمكن أن يقلل بشكل فعال من حدوث تضخيم غير محدد. إنها مناسبة للكشف عن التسلسلات المستهدفة منخفضة الوفرة، مثل الجينات الطافرة التي نادرًا ما توجد أو الكميات الضئيلة من الحمض النووي الممرض.

عالية الدقة PCR

يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل عالي الدقة مناسبًا لتضخيم قوالب الحمض النووي الأطول، كما أن استخدام البوليمرات عالية الدقة يعد أمرًا أساسيًا لتقليل معدل الخطأ في التفاعل بشكل فعال.

RAPD: تحليل الحمض النووي متعدد الأشكال المضخم السريع

RAPD هي أداة تعتمد على PCR لدراسة الكائنات الحية على المستوى الجزيئي. ويستخدم بادئات صغيرة غير محددة لتضخيم المناطق التي تبدو عشوائية من الحمض النووي الجينومي. عند تحليلها على المواد الهلامية agarose، تنتج أزواج التمهيدي الناجحة ملفات تعريف نطاقية مختلفة لمنتجات PCR بين الأفراد والسلالات والأنواع وما إلى ذلك. في RAPD، تُستخدم البادئات لتضخيم الحمض النووي للجينوم.

في RAPD، يبلغ طول البادئات حوالي 10 قواعد فقط. ولذلك، مطلوبة درجات حرارة الصلب <40 درجة مئوية.

الاغتصاب: تحليل سريع للحمض النووي متعدد الأشكال

RACE هو البديل من RT-PCR. وعادة ما يستخدم لاستنساخ [كدنا] المتبقية غير المكتملة. هناك نوعان من التقنيات العامة:

سباق 5' - تضخيم نهاية 5' [كدنا].

سباق 3' - ينتهي تضخيم [كدنا] 3'

تتضمن الخطوة الأولى، وهي نفسها بالنسبة لكلا النوعين من RACE، تحويل الحمض النووي الريبي (RNA) إلى [كدنا] أحادية الجديلة باستخدام إنزيم النسخ العكسي.

الخطوة الثانية فريدة لكل نوع من أنواع RACE، على الرغم من أن كل منها ينتج معلومات قد تؤدي إلى تسلسل [كدنا] كامل الطول.

نظرًا لأن RACE يستخدم 'موقعًا إرساءًا' داخل mRNA كنقطة مرجعية، فإنه يُطلق عليه أحيانًا 'anchored PCR.'

في الموقع PCR

في الموقع، يمكن لـ PCR تحديد العلامات الخلوية وزيادة توطين التسلسلات الخاصة بالخلية داخل مجتمع الخلية. إنها أداة قوية في تطبيقات مثل دراسات تطور المرض.

يمكن أن يستخدم الإجراء عينات من الخلايا أو الأنسجة الطازجة أو الثابتة، ولكن إعداد العينة أمر بالغ الأهمية للنتائج حيث يؤثر التثبيت بشكل مباشر على إشارة PCR. يناسب هذا الإجراء تحقيقات الحمض النووي الموسومة إشعاعيًا أو الموسومة بالفلورسنت أو البيوتين.

العرض التفاضلي PCR

يقوم العرض التفاضلي PCR بمقارنة وتحديد الاختلافات في أنماط التعبير mRNA (والجينات) بين خطين من الخلايا أو المجموعات السكانية.

تم اختراع هذه التقنية في التسعينيات وسرعان ما أصبحت أداة رئيسية لتحليل التعبير الجيني. ومع ذلك، فقد تم استبداله مؤخرًا بـ RNA-seq والمصفوفات الدقيقة وqRT-PCR.

القطرة الرقمية والرقمية PCR (dPCR/ddPCR)

على الرغم من أنه أقل شيوعًا، إلا أن هذا النوع من تفاعل PCR غالبًا ما يستخدم في التطبيقات التي تحتوي على عينات معقدة أو نادرة. يقوم dPCR بتقسيم عينة الحمض النووي إلى عدة أقسام، من المرجح أن تحتوي كل منها على تسلسل واحد. يقوم هذا التحليل بتقدير كمية المادة الأولية في عينة الحمض النووي الأصلية.

PCR الكمي

يُعرف PCR الكمي (qPCR) أيضًا باسم PCR في الوقت الحقيقي. يسجل جهاز التدوير الحراري في الوقت الحقيقي إشارة التألق خلال كل دورة PCR في qPCR.

يختلف بين qPCR وdPCR

يسمح qPCR بالقياس الكمي النسبي للحمض النووي المستهدف ويوفر طريقة موثوقة وراسخة لاختبار وجود أو عدم وجود تسلسلات محددة.

يستخدم dPCR طريقة كيميائية مماثلة للكشف عن تسلسل الحمض النووي ويتم إجراؤه في العديد من الأحجام أو القطرات الصغيرة، باستخدام قوة الرياضيات لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء. فيما يلي مقارنة مختصرة بين الاثنين:

الانزيمات المستخدمة في PCR

هناك العديد من الإنزيمات الرئيسية التي تلعب دورًا مهمًا في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). فيما يلي الإنزيمات المستخدمة بشكل أساسي في عملية PCR:

طق DNA بوليميريز

يعد بوليميريز الحمض النووي طق هو الإنزيم الأكثر كلاسيكية والأكثر استخدامًا في تفاعلات PCR. يمكنه تثبيت نشاطه عند درجات حرارة عالية وهو مناسب للعديد من فحوصات PCR. إعداد رد الفعل على الجليد ضروري لتجنب التضخيم غير محدد أثناء رد الفعل.

بوليمرات الحمض النووي المستخدمة في PCR

بداية ساخنة بوليميريز الحمض النووي

عندما يتم إعداد تفاعل التضخيم في درجة حرارة الغرفة، يمكن أن ترتبط البادئات ببعضها البعض بشكل غير محدد لتكوين ثنايا التمهيدي. خلال دورة التضخيم، يمكن أن تمتد ثنايا التمهيدي لإنتاج منتجات غير محددة، مما يقلل من إنتاجية منتجات معينة.

يعد تشغيل PCR الساخن أمرًا بالغ الأهمية للحصول على نتائج محددة ناجحة لتطبيقات PCR الأكثر تحديًا. لتوليد بوليميريز DNA ذو البداية الساخنة، يمكن للأجسام المضادة أن تمنع نشاط بوليميريز DNA Taq عند درجات حرارة منخفضة.

في المقابل، أثناء البداية الساخنة بوساطة الجسم المضاد، يرتبط الجسم المضاد بالبوليميراز من خلال قوى غير تساهمية ضعيفة نسبيًا، مما يترك بعض جزيئات البوليميراز في حالة نشطة. يؤدي هذا في بعض الأحيان إلى زيادة تضخيم منتجات التمديد التمهيدي غير المحددة أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل. عند تشغيلها على المواد الهلامية الاغاروز، تظهر هذه المنتجات كأجزاء ملطخة أو ذات حجم غير صحيح.

بوليميريز الحمض النووي عالي الدقة

توفر إنزيمات PCR عالية الدقة عادةً نشاط نوكلياز الحمض النووي من 3 إلى 5 بوصات لإزالة القواعد غير المدمجة. إن إنزيمات PCR عالية الدقة مناسبة تمامًا للتطبيقات التي تتطلب معدلات خطأ منخفضة، مثل الاستنساخ والتسلسل والطفرات المستهدفة. ومع ذلك، إذا لم يتم توفير الإنزيم في إصدار البداية الساخنة، فإن نشاط نوكلياز الحمض النووي من 3 إلى 5 بوصات قد يؤدي إلى تحلل البادئات أثناء إعداد PCR والمراحل المبكرة من PCR. قد يؤدي التحفيز غير المحدد الناتج عن البادئات المختصرة إلى حدوث تخلف على الجل أو فشل التضخيم - خاصة إذا تم استخدام كمية صغيرة من القالب.

غالبًا ما تؤدي وظيفة التدقيق اللغوي إلى عمل الإنزيم عالي الدقة بشكل أبطأ من بوليميرات الحمض النووي الأخرى. بالإضافة إلى ذلك، يتم تقليل وظيفة الإضافة A المطلوبة لاستنساخ UA أو TA المباشر بشكل كبير، مما يؤدي إلى الحاجة إلى ربط وتحويل النسخ المسطحة الأقل كفاءة.

النسخ العكسي

يستخدم في تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي (RT-PCR) لنسخ الحمض النووي الريبي (RNA) إلى الحمض النووي المقابل. تتضمن النسخ العكسية شائعة الاستخدام M-MLV Reverse Transcriptase وAMV Reverse Transcriptase.

بوليميريز الحمض النووي القابل للحرارة

يتم استخدامها في المرحلة النهائية من تفاعل PCR لإزالة تلوث الحمض النووي المتبقي المحتمل. تكون هذه الإنزيمات غير نشطة أثناء خطوة PCR الروتينية ولكنها نشطة أثناء خطوة التضخيم النهائية.

تصميم التمهيدي PCR

يعد تسلسل التمهيدي الأمثل وتركيز التمهيدي المناسب أمرًا بالغ الأهمية لتحقيق أقصى قدر من الخصوصية وكفاءة PCR.

تسلسل التمهيدي:

1. تجنب بخس 3-نوكليوتيدات في نهاية 3'، أي استخدم ترميز Met أو Trp الثلاثي في ​​3'.

2. لتحسين كفاءة ربط قالب التمهيدي، قم بتقليل التسلسل عن طريق السماح ببعض حالات عدم التطابق بين التمهيدي والقالب، خاصة في نهاية 5'، ولكن ليس في نهاية 3'.

3. تصميم الاشعال مع أقل من 4 أضعاف البخل في أي موقف معين.

تركيز التمهيدي:

1. ابدأ PCR بتركيز التمهيدي 0.2 ميكرومتر.

2. إذا كانت كفاءة PCR ضعيفة، قم بزيادة تركيز التمهيدي بزيادات 0.25 ميكرومتر حتى يتم الحصول على نتائج مرضية.

مبادئ توجيهية لتصميم واستخدام الاشعال

دليل استكشاف أخطاء PCR وإصلاحها

تجارب PCR. إذا واجهت نتائج عملية لا تلبي التوقعات دائمًا، هل تعرف ما السبب؟ بعد ذلك، سنناقش المشكلات التي قد تحدث أثناء استخدام PCR وتقنيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها: