جهاز التدوير الحراري المتدرج: 'خدعة خفية' لتقليل التضخيم غير المحدد

لماذا ينتج PCR دائمًا مجموعة من النطاقات غير المحددة؟

واحدة من أكثر المشكلات المحبطة في تفاعل البوليميراز المتسلسل هي عندما تظهر نتائج الرحلان الكهربائي مجموعة من النطاقات العشوائية غير المحددة بالإضافة إلى النطاق المستهدف. في بعض الأحيان، تكون الثنائيات التمهيدية أكثر سطوعًا من النطاق المستهدف. عندما يحدث هذا، لا تتسرع في إلقاء اللوم على الاشعال أو القالب. أولاً، تحقق مما إذا كنت قد استخدمت وظيفة فحص التدرج الخاصة بجهاز التدوير الحراري التدرجي بشكل صحيح.

استخدم جهاز تدوير حراري متدرج للعثور بسرعة على درجة حرارة التلدين المثالية

السبب الأكثر شيوعًا للتضخيم غير المحدد هو درجة حرارة التلدين المنخفضة جدًا. يسمح هذا للبادئات بالارتباط بمواقع غير محددة في القالب. في هذه الحالة، بدلاً من إعادة تصميم البادئات، من الأفضل إجراء فحص تدرج درجة الحرارة أولاً باستخدام دورة حرارية متدرجة. الطريقة بسيطة: استنادًا إلى قيمة Tm التمهيدي، قم بتعيين نطاق درجة الحرارة مع تقلب يتراوح بين 5 و10 درجات مئوية. على سبيل المثال، إذا كان Tm التمهيدي هو 60 درجة مئوية، قم بتعيين التدرج من 55 درجة مئوية إلى 65 درجة مئوية. تشغيل 2-3 وإنشاء نسخ متماثلة في كل درجة حرارة، بما في ذلك التحكم السلبي. بعد الترحيل الكهربائي للهلام، حدد درجة الحرارة التي يكون فيها النطاق المستهدف هو الأكثر سطوعًا وتكون النطاقات غير المحددة في حدها الأدنى - وهذه هي درجة حرارة التلدين المثالية.

"خدعة خفية" لتقليل التضخيم غير المحدد

إذا كانت النطاقات غير المحددة لا تزال موجودة بعد فحص التدرج، فيمكنك تجربة وظيفة "Touchdown PCR" على دورة التدرج الحراري. تستخدم هذه الوظيفة درجة حرارة تلدين أعلى خلال الدورات القليلة الأولى. بعد ذلك، يتم خفض درجة الحرارة بمقدار 0.5-1 درجة مئوية لكل دورة حتى تصل إلى درجة حرارة التلدين النهائية التي قمت بتعيينها. يسمح هذا للبادئات بالارتباط بشكل تفضيلي بالموقع المستهدف المطابق تمامًا. وهذا يقلل بشكل كبير من احتمالية التضخيم غير المحدد. في كثير من الحالات، يمكن للعينات التي تفشل في إنتاج نطاقات نظيفة باستخدام البروتوكولات القياسية أن تسفر عن نتائج ممتازة باستخدام بروتوكول PCR الملامس.

ماذا تفعل عندما يكون تضخيم قوالب GC العالية أمرًا صعبًا؟

إذا كان القالب الخاص بك يحتوي على محتوى GC مرتفع بشكل خاص (أكثر من 60%)، فيمكنك إضافة 5%-10% DMSO أو الجلسرين إلى خليط التفاعل أثناء ضبط تدرج درجة الحرارة. ثم استخدم التدوير الحراري المتدرج لفحص درجات حرارة التلدين الأعلى؛ يؤدي هذا غالبًا إلى حل صعوبات التضخيم باستخدام قوالب GC العالية.

في الواقع، يمكن حل معظم مشكلات تضخيم PCR من خلال تحسين الحالة باستخدام دورة حرارية متدرجة.